切向流过滤技术：重组蛋白制备的得力助手
时间：2024.06.17
蛋白质是生物大分子，具有复杂结构和多种功能。蛋白质作为生物学“中心法则”的终产物，是生命活动的主要承担者。深入了解蛋白质结构和功能之间的关联是解锁“生命密码”和揭示所有特定生物学过程机制的关键。虽然从天然来源中提取的蛋白质为其特征研究提供了关键的起始物料，但由于样品差异，蛋白质数量匮乏和质量不一，给蛋白质生物化学领域带来了挑战。
因此，重组蛋白表达的概念应运而生，该过程通过载体将编码靶蛋白（POI）的外源基因引入宿主细胞，并通过劫持宿主细胞的蛋白质制造机制产生POI的过程。
四十多年前，质粒（通常以环状双链DNA分子的形式出现）被确定为细菌中外源基因的主要信使，从而开启了基因工程的新纪元，使重组蛋白表达成为可能。在过去四十年里，研究人员已开发了各种载体系统以及宿主细胞，包括原核生物（大肠杆菌）和真核生物（例如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞），以产生接近其自然状态的广谱重组蛋白，促进生化研究、工业催化、食品加工、疫苗和治疗等方面的发展。
因此，重组蛋白表达的概念应运而生，该过程通过载体将编码靶蛋白（POI）的外源基因引入宿主细胞，并通过劫持宿主细胞的蛋白质制造机制产生POI的过程。
四十多年前，质粒（通常以环状双链DNA分子的形式出现）被确定为细菌中外源基因的主要信使，从而开启了基因工程的新纪元，使重组蛋白表达成为可能。在过去四十年里，研究人员已开发了各种载体系统以及宿主细胞，包括原核生物（大肠杆菌）和真核生物（例如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞），以产生接近其自然状态的广谱重组蛋白，促进生化研究、工业催化、食品加工、疫苗和治疗等方面的发展。
高质量的重组蛋白是研究和药物开发的重要起始材料。重组蛋白质量的关键属性包括纯度、寡聚状态、热稳定性和化学稳定性、折叠、翻译后修饰（PTM）、活性……由于蛋白质本身的复杂性，蛋白质表达和纯化往往具有挑战性。
在对目的蛋白表达纯化时，需要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游对下游的影响。同时，不同的表达系统和培养方法也影响下游的处理过程：目的蛋白表达是否形成包涵体，目的蛋白表达定位（胞内、细胞膜内、壁膜空间和细胞外）。
重组蛋白下游工艺涉及到的膜过滤操作单元有：澄清过滤、切向流过滤、除病毒过滤及除菌过滤等步骤，不同阶段的过滤工艺的开发都需要严格把控。
在对目的蛋白表达纯化时，需要统一考虑和整体设计，并充分考虑上游对下游的影响。同时，不同的表达系统和培养方法也影响下游的处理过程：目的蛋白表达是否形成包涵体，目的蛋白表达定位（胞内、细胞膜内、壁膜空间和细胞外）。
重组蛋白下游工艺涉及到的膜过滤操作单元有：澄清过滤、切向流过滤、除病毒过滤及除菌过滤等步骤，不同阶段的过滤工艺的开发都需要严格把控。
相比于传统的高速离心机结合深层过滤等分离技术，切向流技术则具有高效率、低能耗、无添加化学成分，操作条件缓和等一系列优势。
切向流过滤根据孔径可以分成微滤和超滤，一般微滤（MF）常用于较为精细的固液分离，如重组蛋白的层析前去除细胞/细胞碎片，酵母发酵液，动植物粗提液，大肠杆菌裂解液等，省去传统的离心和预过滤等步骤。
而超滤（UF）使用范围更宽，膜孔径较��，主要用于重组蛋白的脱盐、脱醇和浓缩、内毒素和核酸去除。膜孔径的选择极其重要，超滤膜 1～1000kDa MWCO，微滤膜0.1～0.65um。选择膜孔径均一度高的滤膜，可以保证截留收率同时获得更快地透过速度，有利于杂质的透过去除，改善实验及生产效率，提高产品质量。
切向流过滤根据孔径可以分成微滤和超滤，一般微滤（MF）常用于较为精细的固液分离，如重组蛋白的层析前去除细胞/细胞碎片，酵母发酵液，动植物粗提液，大肠杆菌裂解液等，省去传统的离心和预过滤等步骤。
而超滤（UF）使用范围更宽，膜孔径较��，主要用于重组蛋白的脱盐、脱醇和浓缩、内毒素和核酸去除。膜孔径的选择极其重要，超滤膜 1～1000kDa MWCO，微滤膜0.1～0.65um。选择膜孔径均一度高的滤膜，可以保证截留收率同时获得更快地透过速度，有利于杂质的透过去除，改善实验及生产效率，提高产品质量。
在重组蛋白的制备过程中，切向流技术主要用于以下几个关键步骤：
1. 浓缩
重组蛋白在宿主细胞培养过程中往往以较低浓度存在。切向流技术可以通过选择适当的膜孔径，保留目标蛋白，而让小分子如盐分、水和代谢废物通过，从而实现蛋白的浓缩。
2. 纯化
切向流技术能够有效去除培养基中的杂质，提高重组蛋白的纯度。这一步骤对于减少潜在的免疫原性反应和提高药物的安全性至关重要。
3. 缓冲液置换
在重组蛋白的进一步加工或储存前，可能需要将其从一种缓冲液转移到另一种更适合的缓冲液中。切向流技术可以在不损失蛋白活性的前提下，实现这一转换。
切向流技术虽然广泛地应用于重组蛋白的浓缩、分离纯化，但也有一定的局限性，如果要分离的两种产品的分子量相差不到5倍，则无法用切向流进行分离。
在重组蛋白质分离纯化中，切向流技术是一项应用较广泛的蛋白纯化技术，选择合适的膜材质、孔径、流道网、TMP、工艺流速、剪切力等条件至关重要。单一片面的选择在蛋白质的分离和纯化中效果甚微，要结合蛋白特性、缓冲体系来开展蛋白质的分离，才能将开发的膜过滤工艺成功的放大，获得蛋白较好的分离效果。
1. 浓缩
重组蛋白在宿主细胞培养过程中往往以较低浓度存在。切向流技术可以通过选择适当的膜孔径，保留目标蛋白，而让小分子如盐分、水和代谢废物通过，从而实现蛋白的浓缩。
2. 纯化
切向流技术能够有效去除培养基中的杂质，提高重组蛋白的纯度。这一步骤对于减少潜在的免疫原性反应和提高药物的安全性至关重要。
3. 缓冲液置换
在重组蛋白的进一步加工或储存前，可能需要将其从一种缓冲液转移到另一种更适合的缓冲液中。切向流技术可以在不损失蛋白活性的前提下，实现这一转换。
切向流技术虽然广泛地应用于重组蛋白的浓缩、分离纯化，但也有一定的局限性，如果要分离的两种产品的分子量相差不到5倍，则无法用切向流进行分离。
在重组蛋白质分离纯化中，切向流技术是一项应用较广泛的蛋白纯化技术，选择合适的膜材质、孔径、流道网、TMP、工艺流速、剪切力等条件至关重要。单一片面的选择在蛋白质的分离和纯化中效果甚微，要结合蛋白特性、缓冲体系来开展蛋白质的分离，才能将开发的膜过滤工艺成功的放大，获得蛋白较好的分离效果。